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                      新式冠狀病毒(2019-nCov)核酸檢測流程

                      發布時間:2021-07-18 00:35 人氣: 來源:http://www.gao88.cn

                      北京協和最近公布了《新型冠狀病毒核酸檢測》規范操作步驟。這為大家基本建設2019-nCov新式新冠病毒P3實驗室規劃給予了科學研究具體指導。

                      實際檢驗步驟以下

                      一、dna檢測前的微生物安全防范(工作員本人三級防護的配戴)

                      1、配戴步驟:

                      在基因擴增試驗室的清潔區(換衣區)或是一般試驗室的潔凈區,工作員按序先后配戴好一次性帽子、醫療N95口罩、一次性防護衣、一次性鞋套、一次性防潮靴套、防護目鏡和兩層膠皮手套,進到樣本解決工作中地區或試驗室。

                      2、關鍵點提醒:

                      2.1、具有規范基因擴增合理布局標準的試驗室,應在清理換衣區搞好本人三級防護,標準比較有限的試驗室也可以挑選在一清潔的試驗室中按步驟配戴好本人三級防護。

                      2.2、需配戴醫療N95口罩,如果沒有醫療N95口罩,能夠考慮到用一般N95/KN95口罩另加一次性外科口罩的組成方法,但不必配戴有呼吸閥的N95口罩。

                      2.3、配戴N95口罩時要查驗密封性,根據兩手輕按、深吸氣、上下扭頭等姿勢嚴苛查驗防護口罩是不是配戴恰當。

                      2.4、一次性防護衣已具有新式新冠病毒dna檢測的安全防護要求,有標準時能夠考慮到加穿一次性反穿隔離衣,穿衣服時要由別人幫助。

                      2.5、衣冠整潔的工作員,應按要求盡早進到樣本解決的試驗地區開展工作,禁止配戴三級防護后再進到一般試驗地區或辦公室地區。

                      二、樣本的消滅解決

                      1、操作步驟:

                      兩位進行三級防護的工作員,進到樣本解決區或樣本解決專用型試驗室,將接受到的樣本二級包裝在生物安全柜內開啟,查驗樣本主器皿是不是為嚴苛密閉式;對密封袋表層開展消毒殺菌后,對復檢樣本開展56℃下三十分鐘的消滅,消滅后的樣本管需在生物安全柜內開啟最里層的器皿,將拭子儲存液攪拌后開展散裝和用以核酸提取。

                      2、關鍵點提醒:

                      2.1、涉及到高高致病微生物的試驗室主題活動,需由兩位工作員進行,在其中一人承擔關鍵實驗過程,一人給予必需的幫助。主作業者應防止不斷數次出入生物安全柜。

                      2.2、消滅方式:能夠選用水浴或氣體加溫方式進行消滅,選用氣體加溫時可適度增加消滅時間。有標準時能夠選用微型化機器設備在生物安全柜內實際操作,降低樣本出入生物安全柜的頻次。消滅前的樣本禁止在生物安全柜外開啟和實際操作。

                      2.3、應尤其查驗取樣管是不是扭緊、有沒有樣本溢漏等狀況。

                      2.4、樣版管每一次出入生物安全柜均需對外開放表層開展消毒殺菌。

                      2.5、應就近原則配置適當的消毒殺菌解決物件,以避免 實驗過程全過程中很有可能產生的出現意外溢灑安全事故,有標準時提議在生物安全柜內配置一次性吸濕桌布。

                      三、樣版的核酸提取

                      1、手工制作核酸提取操作步驟(以凱杰的52906柱說法核酸提取檢測試劑盒為例子)

                      1.1、裂解液配置:在基因擴增試驗室的實驗試劑配置區或獨立的一般實驗試劑配置試驗室中,提前準備核酸提取需要的洗液1(AW1)、洗液2(AW2)和carrier RNA。依照規定,各自向洗液1和洗液2中添加生物學等級的130ml和160ml的工業乙醇并立即搞好標識;取310μl過柱液(AVE)融解310μg/支的Carrier RNA。配備好后,根據不銹鋼傳遞窗進到核酸提取區或由工作員送進核酸提取專用型試驗室。

                      1.2、樣版裂解:560μl AVL裂解液到1、5ml無菌檢測EP管內,添加5、6μl配置好的Carrier RNA,再添加早已消滅的140μl樣版(比如咽拭子、血液等),攪拌震蕩15秒,室內溫度靜放十分鐘,充足裂解樣版中的核苷酸。將EP管瞬間離心后添加560μl工業乙醇,充足攪拌15秒,再度瞬間離心儲備用。汲取630μl裂解物質,當心添加至離心柱中,8000rpm(或6000g)離心1分鐘,遷移離心柱至新搜集管,將剩下630μl裂解物質加到離心柱中,反復上一離心實際操作(若樣版容積超過140μl,則在這里流程反復將630μl裂解物質過慮搜集在一個離心柱上)。

                      1.3、核苷酸的清洗:500μl洗液1(AW1)至離心柱中,8000rpm(或6000g)離心1分鐘;換新搜集管拔,取500μl洗液2(AW2)至離心柱中,8000rpm(或6000g)離心1分鐘;換新搜集管拔,用14000rpm(或20000g)離心3分鐘,除去洗液2(AW2);換新搜集管拔,再次用離心機較大 轉速比(20000g)離心1分鐘,充足甩離殘余的洗液2(AW2)。

                      1.4、核苷酸的過柱和回收利用:取一1、5ml無菌檢測EP管,將離心柱放進在其中,添加過柱液(AVE)40~60μl,室內溫度靜放1分鐘后,用8000rpm離心1分鐘回收利用核苷酸,以便PCR檢驗應用。

                      1.5、關鍵點提醒:

                      1)、新鮮裂解液的配置應盡量在專業的清潔地區或獨立的試驗室開展。

                      2)、要用生物學等級的工業乙醇實驗試劑開展配置。

                      3)、向離心柱中添加裂解物質、洗液時實際操作要十分當心,盡可能將洗頭發下挫到離心柱內部后靠壁厚加樣,切勿發生溢灑后環境污染到離心柱的密封環,這很有可能會造成 酒精殘余,抑止事后PCR反映。

                      4)、從離心機中取下離心柱時應當心實際操作,防止離心柱外緣被搜集管內的濾過殘液環境污染。

                      5)、添加洗液2(AW2)后的第二次空管局飛速離心十分重要,能協助充足甩離離心柱濾紙中殘余的洗液2殘液,保證 過柱核苷酸的純凈度。

                      6)、過柱液加樣時要當心實際操作,保證 過柱液盡量遮蓋所有離心式柱濾紙,充足過柱核苷酸,提升 核酸提取的生產量。

                      7)、手工制作核酸提取可甄選應用檢驗試劑盒使用說明強烈推薦的配套設施手工制作獲取試劑,也可采用通用性手工制作獲取試劑。

                      8)、樣版處理方式中,工作員感覺必須時,應隨時隨地拆換新的表層膠皮手套。

                      2、選用核酸提取儀獲取核苷酸的操作步驟

                      依據核酸提取儀和試劑的使用說明準備好獲取試劑,取200μl樣版上機操作獲取核苷酸,并依照規定回收利用獲取好的核苷酸預留。

                      關鍵點提醒:

                      1、不一樣的獲取儀器設備和試劑的獲取高效率很有可能存有差別,請一定嚴苛依照獲取試劑盒的使用說明開展核酸提取實際操作。

                      2、有標準時能夠考慮到配置微型化的核酸提取儀在生物安全柜內應用,以進一步加強微生物安全防范;若應用在生物安全柜外的核酸提取儀,則一定要搞好微生物安全防范及樣版的污染治理維護。

                      、PCR管理體系的配置和模版加樣

                      1、操作步驟:

                      在基因擴增試驗室的試劑配置區或獨立的專用型試驗室,配置PCR管理體系。依據試劑盒使用說明的規定,將試劑盒的不一樣成分(一般包含反映液、酶、引物設計等)依照分別務必的容積量開展配置混和,充足攪拌并離心式后,根據不銹鋼傳遞窗傳送到核酸提取和加樣區,或由專職人員從試劑配置試驗室送至核酸提取和加樣專用型試驗室。在加樣專用型生物安全柜內,依據檢驗樣版樣本數散裝管理體系到每一個反映管內,逐一將樣版核苷酸添加到相匹配的反映管內,并蓋上密閉式好PCR反映管;每批號檢驗必須做一個陽性對照和3個陰性對照。

                      2、關鍵點提醒:

                      1)、試劑配置務必嚴苛在試劑配置區或獨立、清潔的專用型試驗室和生物安全柜內開展,以保證 試劑不容易有被環境污染的很有可能。

                      2)、試劑配置時要依據檢驗樣版總數開展有效配置,每批號檢驗均必須包含3個陰性對照和一個陽性對照的試劑,與此同時還必須考慮到試劑分派全過程中的一切正常耗損等耗費。

                      3)、加樣能夠和樣版解決/核酸提取在同一系統分區或同一間試驗室開展,但若有標準最好是在獨立的加樣區或最少應用專用型生物安全柜開展加樣。

                      4)、管理體系散裝提議每一次拆換新的吸頭,防止不斷應用產生容積偏差和交叉式環境污染。

                      5)、應配備管理體系加樣申請表,保證 加樣全過程準確。

                      6)、PCR密閉式管蓋應尤其慎重,提議拆換新的手套,避免 手套等觸碰管蓋內部帶到環境污染的風險性。

                      、上機操作檢驗及結果剖析

                      1、操作步驟:

                      在擴增區或專用型擴增試驗室,由專職人員取下配置好的PCR檢驗管,攪拌、離心式后,當心上機操作檢驗,依照檢測試劑盒使用說明設定擴增主要參數并剖析判斷結果。開展結果剖析時,應用心閱讀文章檢測試劑盒使用說明,在掌握該檢測試劑盒的敏感度、檢驗方式 和局限等技術性特性的基本上,融合該批號呈陰性質量控制的結果,綜合性判斷樣版的檢驗結果。檢驗完畢后,為避免 很有可能的擴增環境污染,擴增完畢后的PCR管禁止打開表蓋或看押擴增試驗室,應盡早根據可密封性包裝袋等器皿盛放密閉式后,放進特定專用型醫療垃圾桶中做進一步解決。

                      2、關鍵點提醒:

                      1)、因遺傳基因擴增區存有環境污染的風險性,應設專業的擴增地區或在獨立的專用型試驗室開展擴增,務必和核酸提取、實驗試劑配置地區有嚴苛的物理學切分。

                      2)、不一樣實際操作地區的工作服裝不必混穿,尤其是遺傳基因擴增區的工作服裝,提議僅在擴增地區或擴增試驗室內應用。

                      3)、了解檢驗用PCR儀器的基本上特性和特性,能客觀性具體分析檢驗結果。

                      、檢驗后的消毒殺菌解決

                      1、操作步驟:

                      1、生物安全柜內:在進行樣版核酸提取后,應在生物安全柜上用75%消毒酒精對表層手套開展消毒殺菌解決,并將表層手套取出后棄至生物安全柜內的垃圾箱中。當心收納整理并丟掉應用過的一次性吸濕桌布,用0、5%~1%的次氯酸鈉溶液消毒液或75%酒精擦拭安全性銀行柜臺面、移液器等生物安全柜內所有儀器設備的表層。將生物安全柜內造成的新式新冠病毒有關醫療廢物經3層包裝后,遷移至試驗室的專用型醫療垃圾桶中。打開紫外線殺菌燈直射生物安全柜,時間應超過三十分鐘。

                      2、樣版核酸提取工作員試驗室內:別人幫助用0、5%~1%的次氯酸鈉溶液消毒液或75%乙醇勻稱噴撒里層手套、衣袖、胳膊及隔離衣后,將表層反穿隔離衣脫掉至新式新冠病毒專用型醫療垃圾桶中送髙壓解決。

                      3、樣版解決試驗室內:0、5%~1%的次氯酸鈉溶液消毒液或75%醫用酒精消毒實驗室臺面和路面;開紫外線殺菌燈開展超過三十分鐘的空間消毒。

                      4、工作員摘脫三級防護:在緩沖區域戴新的表層手套,摘防護眼鏡放置75%乙醇泡浸消毒殺菌,重新開始,由上而下、從里到外遲緩旋轉脫掉一次性防護衣,直至將一次性防潮靴套所有脫掉,將防護衣放置新式新冠病毒專用型醫療垃圾桶中送髙壓解決。摘防護口罩、遮陽帽、里層腳套和里層手套后一樣放置新式新冠病毒專用型醫療垃圾桶中送髙壓解決。

                      5、新式冠狀病毒有關醫療廢物:全部新式冠狀病毒有關醫療廢物均需經寒濕高壓滅菌后再做為一般診療生活垃圾處理,且塑料袋應該標明新式冠狀病毒醫療廢物的有關信息。髙壓解決前后左右的廢棄物要嚴苛區別,在高壓滅菌專用型地區對新式冠狀病毒醫療廢物開展寒濕高壓滅菌解決,髙壓主要參數為121℃、30分鐘。髙壓要做物理學、微生物標示,以保證 高壓滅菌的實際效果。

                      2、關鍵點提醒:

                      1)、生物安全柜內是風險性最大地區,作業者的表層膠手套經消毒殺菌后務必脫在生物安全柜內。

                      2)、靴套或腳套的關鍵功效是對作業者的腳和腳部開展安全防護,規定務必防潮,以保證 在試驗室內出現意外遺灑時可防護環境污染。

                      3)、核酸提取儀內部、生物安全柜內部和試驗室室內空間均應開展紫外線殺菌,但紫外光對氣體的消毒殺菌效果非常的好,對物件表層的消毒殺菌實際效果隨間距變遠而變弱,故在紫外線殺菌前,仍需對各種各樣儀器設備表層、櫥柜臺面、路面用消毒液開展擦洗消毒殺菌。

                      4)、工作員在摘脫本人三級防護后,仍應參考試驗室原來試驗后操作步驟開展嚴苛用心的基本消毒殺菌解決,尤其是試驗后的手衛生階段。

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